張鋒、姜凱議等揭示CRISPR-Cas系統控制蛋白酶

責編 | 酶美

CRISPR-Cas系統是原核生物防禦外敵遺傳元件侵襲的適應性免疫手段。目前已發現CRISPR-Cas系統gRNA靶向調控切割DNA或者RNA核酸酶；還發現有gRNA靶向調控的DNA轉座酶【1，2】。除上述核酸操控加工的CRISPR系統外，還存在有一類是CRISPR系統控制的蛋白酶【3，4】。

隸屬於Class I家族的Type III-E亞型效應蛋白Cas7-11是類特殊的CRISPR系統，系統內多效應亞基融合形成一個巨大的單亞基，命名爲gRAMP（Giant Repeat Associated Mysterious Protein）。與gRAMP基因位點鄰近有THP/CHAT蛋白酶（Csx29），可與gRAMP形成複合物。2022年8月25日，Science發表了可愛龍團隊胡純一博士領銜的研究論文，他們經過結構與功能詳盡分析，揭示了Cas7-11通過gRNA靶向激活蛋白酶Csx29，Csx29蛋白酶對同樣位於鄰近的底物Csx30進行切割（請見：專家點評Science丨革命性新工具——sgRNA引導和RNA激活的蛋白酶系統）。

Csx30蛋白功能尚不清楚，其被切割後對生物的生理意義也不清楚。8月18和8月22日，bioRxiv預印本網站上，分別上傳了日本東京大學Hiroshi Nishimasu、美國麻省理工大學 Jonathan S. Gootenberg團隊合作題爲RNA-triggered protein cleavage and cell death by the RNA-guided type III-E CRISPR-Cas nuclease-protease complex ，以及北京化工大學馮越教授與清華大學楊茂君教授合作題爲Structural and functional insights into the type III-E CRISPR-Cas immunity 的兩篇論文（Mol Cell | 馮越/楊茂君合作揭示III-E型CRISPR-Cas系統的免疫機制），該兩篇論文不僅闡述了在gRNA激活蛋白酶Csx29並切割蛋白底物Csx30；並且這兩篇論文都同時明確證實了Csx30切割之後會誘導細胞死亡。

2022年11月3日，Science再次發表了兩篇關於Cas7-11系統的背靠背研究。來自東京大學Nishimasu實驗室的Kazuki Kato、Sae Okazaki和來自麻省理工Gootenberg實驗室的姜凱議、Schimidt-Ulms以共同一作發表名爲 RNA-triggered protein cleavage and cell growth arrest by the type III-E CRISPR nuclease-protease 的文章。作者們首次揭示Cas7-11,CSX29, CSX30 和RPOE作爲細菌免疫系統的作用。研究發現Cas7-11和Csx家族的蛋白形成gRNA激活的蛋白酶系統並且重新把此係統編程爲人源細胞內可用的翻譯後報告基因系統。來自Broad研究院的張鋒/Strecker團隊發表了研究：RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase，論文對Cas7-11、crRNA激活Csx29蛋白酶活性的機制進行了結構與功能研究。研究還展示了Csx30被切割後，解除了對sigma因子的抑制，開放了一批新基因轉錄。利用這一體系，張團隊開發了RNA檢測體系。下面以Nishimasu-Gootenberg論文進行介紹。

III-E 型 CRISPR-Cas7-11 結合 CRISPR RNA (crRNA) 和蛋白酶 Csx29，並催化 crRNA 引導的 蛋白切割。Nishimasu和Gootenberg研究報告了帶有和不帶有靶 RNA 的 Cas7-11–crRNA–Csx29 複合物的低溫電子顯微鏡結構，以及RNA結合誘導Csx29的構象變化。

作者們隨後通過體外的生化實驗揭示了 Csx29 對輔助蛋白 Csx30 的靶向 RNA 依賴性蛋白切割。細菌系統的重建表明，Csx30 裂解產生有毒蛋白質片段，導致生長停滯，這是由 Csx31 調節的。Csx30 結合 Csx31 和相關的 sigma 因子 RpoE會調控細胞生長速度，表明 Csx30 介導的 RpoE 抑制調節是細胞對感染的反應。

最後，作者們重新編程了 Cas7-11–Csx29–Csx30 系統，用於哺乳動物細胞中的可編程 RNA傳感。利用人源細胞內高效的蛋白降解系統，Csx30作爲可被切割的蛋白被置於熒光蛋白和降解蛋白 (DHFR) 的中間。作者證明此係統可以根據細胞內源RNA的存在等比切割帶有降解子的熒光蛋白，以起到RNA傳感的作用。

總體而言，作者證明Cas7-11–Csx29 效應器是一種 RNA 依賴性核酸酶-蛋白酶系統並且爲細菌對抗噬菌體免疫系統的重要部分。此係統在轉譯後的蛋白級別進行計算，所以擁有檢測癌細胞和特定細胞亞型的潛質。

CRISPR系統-蛋白酶多維度工作原理（來自張鋒文章）

原文鏈接：

1. http://doi.org/10.1126/science.add7347

2. http://doi.org/10.1126/science.add7450

製版人：十一

參考文獻

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2. G. Faure, S. A. Shmakov, W. X. Yan, D. R. Cheng, D. A. Scott, J. E. Peters, K. S. Makarova, E. V. Koonin, CRISPR-Cas in mobile genetic elements: Counter-defence and beyond. Nat. Rev. Microbiol. 17, 513–525 (2019).

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4. S. A. Shmakov, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, K. V. Severinov, E. V. Koonin, Systematic prediction of genes functionally linked to CRISPR-Cas systems by gene neighborhood analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E5307–E5316 (2018).

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